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蛋白质印迹法电泳

蛋白质印迹法(免疫印迹试验)就是Western Blot。作为一种实验方法。它常被用于分子生物学、生物化学和免疫遗传学中。生物组织样品或者凝胶电泳处理过的细胞经过特异性抗体着色,通过对着色的位置和着色深度的分析来使特定蛋白质在所分析的细胞或组织中表达情况的信息获得。


电泳

电泳时间通常为4-5个小时,40V电压比较好,60V也能够使用。当电泳至溴酚兰刚跑出,就能够使电泳终止,然后转膜。


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转膜

1、需要1张7.3~8.6cm的NC膜或PVDF膜和6张7.0~8.3cm的滤纸用作转一张膜的准备。由于膜会受到手上的蛋白的污染,所以一定要戴手套切滤纸和膜。将切好的NC膜或PVDF膜放在水上浸两个小时才能够使用。用镊子往有超纯水的平皿里放置膜,要使膜在水上漂浮。与水接触的是膜的下层。整个膜会在毛细管作用下浸湿,如果膜浸没在水中,就会有一层空气膜在膜与水之间形成,如此就会对膜吸水起到阻挠作用。将滤纸、浸过的膜、一支玻棒、两块海绵垫、以及转膜用的夹子放入到了加有转移液的搪瓷盘里。


2.打开夹子,保持黑的一面水平,将一张海绵垫垫在上面,为了将里面的气泡擀走,需要用玻棒来回擀几遍。将三层滤纸垫在垫子,一手将滤纸固定,一手用玻棒将其中的气泡擀去。


3、需要先撬掉玻璃板才能够剥胶,要轻轻的反复撬两个边。将小玻璃板除去后,轻轻刮去浓缩胶,要防止刮破分离胶。在滤纸上要将分离胶盖小心剥下,为了使其与滤纸对齐,用手调整,轻轻用玻棒将气泡擀去。在胶上盖上膜,需要将气泡去除并且将整个胶盖满。将3张滤纸盖在膜上并且将气泡除去,zui后将另一个海绵垫盖上。擀几下就能够将夹子合起。在转移液中进行整个操作,要不断的将气泡擀去。由于膜两边的滤纸接触后会发生短路,因此它们不能相互接触。


4。在转移槽中放入夹子,要使夹的白面对槽的红面,夹的黑面对槽的黑面,电转移时会有热产生,为了对槽降温,可以在冰水混合物中埋入转移槽,或者将一块冰放在槽的一边。通常使用40V转移3小时或60V转移2小时,或者80V转移1小时。


5.转完后用1×丽春红染液对膜染色5分钟。然后将没染上的染液用水冲洗掉,膜上的蛋白就能够看到,晾干膜备用。


2019-08-29 17:49:56 浏览次数:88次

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