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蛋白质印迹法免疫反应、化学发光和分析

蛋白质印迹法(免疫印迹试验)就是Western Blot。作为一种实验方法。它常被用于分子生物学、生物化学和免疫遗传学中。生物组织样品或者凝胶电泳处理过的细胞经过特异性抗体着色,通过对着色的位置和着色深度的分析来使特定蛋白质在所分析的细胞或组织中表达情况的信息获得。


免疫反应

1、在含有封闭液的平皿中移入使用TBS从下向上浸湿了的膜,室温下脱色摇床上摇动封闭一个小时。


2。用TBST在1。5ml离心管中将一抗稀释至适当浓度,在实验台面上铺上适当大小的一块儿保鲜膜,用水将四角浸湿,从而保持保鲜膜平整。在保鲜膜上加上抗体溶液,将膜从封闭液中取出,将残留液用滤纸吸去后,在抗体液面上面朝下放入膜蛋白。将膜四角掀动从而将残留气泡赶出,室温下孵育1到2个小时,在室温下TBST脱色,摇床上洗两次,每次十分钟,然后再使用TBS洗一次。


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3.对二抗稀释液进行准备并且接触膜,对步骤2中zui后一步重复,从而使得化学发光反应进行。


化学发光

1.在保鲜膜上等体积混合A和B两种试剂,一分钟以后,将膜蛋白面朝下,使其充分接触此混合液。再一分钟以后,往另一保鲜膜上移入膜,将残液去尽,包好,在X-光片夹中放入。


2.在暗室中,在塑料盘中分别倒入1×显影液和定影液。将X-光片从红灯下取出,用切纸刀进行适当大小的剪裁,将X-光片夹打开,在膜上放上X-光片,一旦放上,就不可以移动,将X-光片夹关上,然后计算时间。按照信号的强弱对曝光时间进行适当的调整,通常是一分钟或者五分钟。为了使zui佳效果达到,也能够选择不同时间多次压片。结束曝光后,将X-光片夹打开,并且将X-光片取出,在显影液中迅速浸入并且显影,等到有明显条带出现以后,马上将显影终止。显影时间通常是1-2分钟(20~25℃),如果温度过低(低于16℃),需要对显影时间适当地延长。完成显影后,立刻在定影液中浸入X-光片,定影时间通常为5~10分钟,直到胶片透明为止,残留的定影液使用自来水冲去以后,在室温下晾干。值得留心的是,为了不影响结果,在显影和定影移动胶片尽量拿胶片一角,胶片不能够被手指甲划伤。


凝胶图象分析

扫描或拍照胶片,目标带的分子量和净光密度值使用凝胶图象处理系统来进行分析。



2019-08-29 17:55:21 浏览次数:99次

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